由于單分子膜性能獨(dú)特，受到關(guān)注度越來(lái)越高，利用LB膜技術(shù)制備了二乙氨乙基(DEAE)-瓊脂糖單分子層。分析其表面壓(π)-面積(A)曲線，崩潰壓較高，成膜過(guò)程明顯。研究濃度對(duì)DEAE-瓊脂糖成膜情況的影響，確定最佳成膜濃度為0.5 mg/mL?？疾炫浠芏扰c表面電勢(shì)的關(guān)系，其表面電勢(shì)隨著配基密度的增加而增大。采用原子力顯微鏡(AFM)和布魯斯特角顯微鏡(BAM)對(duì)制備的LB膜進(jìn)行了表征，得出表面膜的表面平整、緊密，厚度約為7.9 nm。DEAE-瓊脂糖LB膜制備成功，為以后LB膜技術(shù)的廣泛應(yīng)用提供了一種新的材料。

近年來(lái)，隨著分子技術(shù)的不斷發(fā)展，人們對(duì)分子水平材料的關(guān)注度越來(lái)越高，這就包括單分子膜制備技術(shù)。單分子膜應(yīng)用十分廣泛，如傳感器、檢測(cè)器、非線性光學(xué)器件的制備以及生物薄膜的簡(jiǎn)化模擬等。利用單分子膜在分子水平對(duì)材料進(jìn)行制備和研究，已經(jīng)成為最近的熱門(mén)課題。

常用的制備單分子膜方法主要有分子自組裝和Langmuir-Blodgett(LB)膜技術(shù)兩種。分子自組裝是構(gòu)膜分子通過(guò)分子間及其與基底材料間的物化作用而自發(fā)形成的一種熱力學(xué)穩(wěn)定、排列規(guī)則的單層(或多層)分子膜[1]。張一芳等[2]在金電極表面自組裝1,6-己二硫醇(HDT)單分子膜，通過(guò)納米金與巰基間的金硫鍵(Au-S)作用組裝一層金納米顆粒構(gòu)建傳感界面，作為電化學(xué)免疫傳感器用于瘦肉精——克倫特羅(CL)的檢測(cè)。馬翠翠[3]研究了基于紫外光降解自組裝單分子層的紙芯片及其應(yīng)用。LB膜技術(shù)是在室溫條件下，將兩親性分子在氣液界面上施加橫向壓力使其有序排列，最后將單分子薄膜轉(zhuǎn)移到特定固體基底表面的薄膜制備技術(shù)[4]。Zou等[5]利用LB膜技術(shù)制備了納米金顆粒和聚苯胺單分子薄膜作為化學(xué)傳感器，用于尿酸和腎上腺素的檢測(cè)。Lee等[6]制備了基于鈀納米顆粒的單壁碳納米管LB膜，作為一種氫氣傳感器。白燁[7]利用LB膜技術(shù)制備帶有功能性基團(tuán)的寡聚對(duì)苯撐乙烯(OPV)制備單分子層薄膜，為開(kāi)發(fā)有機(jī)光電分子器件奠定了一定的基礎(chǔ)。相對(duì)于分子自組裝來(lái)說(shuō)，LB膜技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)在于制備的單分子層膜厚度可控制到分子級(jí)甚至納米級(jí)，成膜物分子排列取向可控，成膜條件簡(jiǎn)單，不需要破壞成膜材料的結(jié)構(gòu)，轉(zhuǎn)移方式簡(jiǎn)便，利于后續(xù)修飾或偶聯(lián)等[8-10]。

多糖類物質(zhì)作為一種生物大分子，其研究應(yīng)用一直是人們關(guān)注的熱點(diǎn)[11-12]。在醫(yī)藥領(lǐng)域中，改性后納米纖維素可以應(yīng)用于疏水性藥物的傳遞[13]，改性后的羥乙基纖維素(HEC)與透明質(zhì)酸(HA)結(jié)合應(yīng)用于研究異甘草素的透皮給藥[14]，改性后的瓊脂糖可以用于抗癌藥物實(shí)驗(yàn)[15]。在生化領(lǐng)域中，改性后的DEAE-瓊脂糖可以作為一種層析分離介質(zhì)的重要基質(zhì)，具有硫酸根含量低、凝膠強(qiáng)度高、電內(nèi)滲低等性能[16-17]，廣泛應(yīng)用于凝膠電泳、層析分離和免疫學(xué)研究等方面[18]。DEAE-瓊脂糖作為一種生物高分子化合物，適用于單分子膜的制備[19]，可以為單分子層膜的發(fā)展應(yīng)用提供一種新型材料。

本研究擬制備改性的DEAE-瓊脂糖LB膜，優(yōu)化鋪展溶劑，測(cè)定其面積-表面壓曲線，確定最佳成膜濃度，研究不同配基密度對(duì)表面電勢(shì)的影響，利用AFM、BAM對(duì)其進(jìn)行表征，建立DEAE-瓊脂糖LB膜的制備方法，為單分子層研究提供新的資源。

1材料與方法

1.1材料與儀器

1.1.1材料

瓊脂糖購(gòu)自普洛麥格(北京)生物技術(shù)有限公司，單晶硅片(晶向?yàn)镹[100])購(gòu)自北京中科科儀技術(shù)發(fā)展有限責(zé)任公司，其他試劑均為市售分析純。

1.1.2儀器

LB膜分析儀，KN芬蘭Kibron公司MicroTrough；原子力顯微鏡(AFM)；小型布魯斯特角顯微鏡(BAM)，瑞典百歐林科技有限公司。

在各功率一定時(shí)，隨著臭氧發(fā)生器出氣流量的增大，臭氧的濃度隨之減小，這主要是由于流量越小時(shí)，氧氣在臭氧發(fā)生器里的停留時(shí)間就越久，有利于臭氧的產(chǎn)生，并且各曲線呈現(xiàn)出斜率相似的趨勢(shì)，說(shuō)明氧氣的濃度與氧氣在臭氧發(fā)生器的停留時(shí)間基本成正相關(guān)，但同時(shí)應(yīng)考慮流量越小時(shí)，相同功率下反應(yīng)器內(nèi)的溫度比更大的出氣流量有所增高，會(huì)促進(jìn)臭氧分解，因此，建議出氣流量不低于30Nm3/h。與此同時(shí)，臭氧的產(chǎn)量卻隨著流量的增大而增大，這主要是由于出氣流量在臭氧產(chǎn)量中所占比重更大，同時(shí)由于臭氧濃度與出氣流量的變化曲線均為線性，因此，各臭氧產(chǎn)量隨流量變化的曲線也呈現(xiàn)出線性關(guān)系。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 DEAE-瓊脂糖制備

將1 g瓊脂糖粉加入到50 mL水中，加熱攪拌使其全部溶解。取6 mL熱溶液于三角瓶中，加入等體積14%的NaOH溶液，同時(shí)加入1 mg NaBH4,50℃搖床堿化40 min后加入2.06 g DEAE繼續(xù)反應(yīng)1 h，反應(yīng)結(jié)束后，35℃透析至中性，凍干。

1.2.2硅片的處理

將1 cm×1 cm的硅片用乙醇、丙酮和超純水分別超聲波清洗各5 min，以除去硅片表面的有機(jī)雜質(zhì)和水溶性雜質(zhì)。將清洗好的硅片浸泡在新配制“Piranha”溶液(98%硫酸與30%的H2O2體積配比7∶3)中2 h，溫度為90℃，使硅片表面產(chǎn)生硅羥基端，然后用大量超純水超聲波清洗[20]。

1.2.3 LB膜制備

在室溫下，亞相為超純水，滴加300μL DEAE-瓊脂糖溶液(正丁醇，0.5 mg/mL)，揮發(fā)1.5 h，壓膜速率為5 mm/min。

1.2.4 LB膜提拉

1.2.5原子力顯微鏡

沉積在硅片上的薄膜用原子力顯微鏡間接接觸模式進(jìn)行檢測(cè)，范圍由大到小進(jìn)行掃描，圖像由NanoScope Analysis軟件進(jìn)行處理。

2結(jié)果與討論

2.1鋪展溶劑的篩選

通過(guò)性質(zhì)比較、實(shí)驗(yàn)測(cè)試，篩選不同的鋪展溶劑，最終選取正丁醇為鋪展溶劑。鋪展溶劑的作用是使亞相上的分子隨著鋪展溶劑在亞相表面的擴(kuò)展揮發(fā)，分子均勻分布在亞相表面。鋪展溶劑應(yīng)具有良好的揮發(fā)性和不溶于亞相這兩個(gè)特性。常用的鋪展溶劑有氯仿、甲醇等。然而，由于瓊脂糖DEAE化之后增加了親水性，不溶于氯仿等常用鋪展溶劑，經(jīng)過(guò)篩選后使用正丁醇作為鋪展溶劑。正丁醇能溶解DEAE-瓊脂糖，同時(shí)難溶于水，揮發(fā)性較好，符合鋪展溶劑所需條件。考慮到正丁醇的揮發(fā)性遠(yuǎn)遠(yuǎn)不如氯仿等溶液，按照制備LB膜的方法僅在亞相上滴加正丁醇，獲得其面積-表面壓曲線，并與滴加DEAE-瓊脂糖-正丁醇溶液的進(jìn)行比較，結(jié)果見(jiàn)圖1。從圖1中可以看出，與DEAE-瓊脂糖溶液的表面壓-面積曲線相比，正丁醇在相同時(shí)間內(nèi)表面壓變化非常小，可以忽略不計(jì)，因而，正丁醇是一種適合DEAE-瓊脂糖的鋪展溶劑，經(jīng)揮發(fā)后可使DEAE-瓊脂糖均勻分布在亞相表面。

圖1面積-表面壓圖像

a:滴加DEAE-瓊脂糖-正丁醇溶液；b：只滴加正丁醇

2.2朗格繆爾膜成膜過(guò)程

2.2.1朗格繆爾膜表面壓-面積圖像

圖2 DEAE-瓊脂糖LB膜的表面壓-面積曲線(0.5 mg/mL,300μL)

利用LB膜分析儀研究了DEAE-瓊脂糖LB膜成膜面積-表面壓圖像，得出DEAE-瓊脂糖LB膜的表面壓-面積曲線(圖2)。結(jié)果表明DEAE-瓊脂糖LB膜制備成功。一般來(lái)說(shuō)，朗格繆爾膜的形成過(guò)程中會(huì)出現(xiàn)氣態(tài)、液態(tài)和固態(tài)這3種形態(tài)，成膜之后再壓縮則會(huì)出現(xiàn)崩潰。從圖2中可以看出，在DEAE瓊脂糖成膜過(guò)程中，a點(diǎn)DEAE-瓊脂糖溶液剛剛被滴加在亞相表面上，此時(shí)DEAE-瓊脂糖分子間距較遠(yuǎn)，在亞相表面呈分散狀態(tài)鋪散開(kāi)來(lái)，每個(gè)分子所占面積較大，分子呈氣相狀態(tài)，表面壓幾乎為零。經(jīng)過(guò)一定的揮發(fā)時(shí)間后，滑障從b點(diǎn)開(kāi)始緩緩壓縮，隨著滑障的壓縮分子之間距離逐漸變小，每個(gè)分子所占面積隨之變小，表面壓開(kāi)始緩緩上升，呈液相狀態(tài)。滑障壓縮一段時(shí)間后，DEAE-瓊脂糖間距變得相對(duì)較小，開(kāi)始由液態(tài)向固態(tài)轉(zhuǎn)變，到達(dá)途中的c點(diǎn)。此時(shí)繼續(xù)壓縮，DEAE-瓊脂糖分子間距快速減小，分子之間排列緊密，每個(gè)分子所占平均面積很小，表面壓上升較快，基本形成固相狀態(tài)的單分子膜。此時(shí)繼續(xù)壓縮，固相狀態(tài)保持到d點(diǎn)時(shí)到達(dá)其崩潰壓力，分子間距到達(dá)最小值，表面壓升至最高，再壓縮則會(huì)破壞所形成的固相單分子層，出現(xiàn)瞬間崩潰。經(jīng)分析看出，DEAE-瓊脂糖LB膜的成膜過(guò)程與其他材料成膜過(guò)程符合，是標(biāo)準(zhǔn)的朗格繆爾膜成膜過(guò)程，可為后續(xù)實(shí)驗(yàn)鋪墊一定的基礎(chǔ)。

2.2.2不同濃度DEAE-瓊脂糖朗格繆爾膜制備

圖3不同濃度DEAE-瓊脂糖表面壓-面積曲線

a:0.15 mg/mL；b:0.5 mg/mL；c:1.0 mg/mL

利用LB膜儀制備了不同濃度的DEAE-瓊脂糖單分子膜，研究了其性質(zhì)，圖3為不同濃度DEAE-瓊脂糖表面壓-面積圖像，結(jié)果表明成膜的最佳濃度為0.5 mg/mL。濃度為影響成膜條件的一個(gè)重要參數(shù)，通過(guò)對(duì)圖像結(jié)果分析得知DEAE-瓊脂糖朗格繆爾膜穩(wěn)定性隨著溶液濃度的增加先變大后減小。從圖3中可以看出，溶液濃度為0.15 mg/mL時(shí)，表面壓不斷上升，沒(méi)有達(dá)到穩(wěn)定的固相狀態(tài)，這種情況下沒(méi)有形成可提拉的固相膜。直至濃度增加到0.5 mg/mL時(shí)，出現(xiàn)相對(duì)穩(wěn)定的表面壓，約為35～37 mN/m，在此區(qū)域內(nèi)單分子膜為固相狀態(tài)，性質(zhì)穩(wěn)定，易于將其提拉到基片上。之后再增加溶液濃度到1.0 mg/mL，相對(duì)穩(wěn)定的固相區(qū)域沒(méi)有出現(xiàn)，不能形成穩(wěn)定可提拉的條件。對(duì)于此結(jié)果的產(chǎn)生可能有以下原因：當(dāng)溶液的濃度很低時(shí)，在滴加量相同的條件下，所滴加在亞相上的分子數(shù)量較少，壓縮到最后，分子間距變小，但由于分子數(shù)量有限，每個(gè)分子所占面積相對(duì)較大；提高溶液的濃度到一定范圍，滴加在亞相上的分子數(shù)量變多，隨著滑障的壓縮分子之間不斷靠攏，形成穩(wěn)定的單分子層固相區(qū)域，再壓縮直到分子間距到達(dá)臨界狀態(tài)，不能承受滑障壓力，出現(xiàn)斷裂堆層，固相區(qū)域瓦解崩潰，表面壓迅速下降；此后再提高溶液的濃度，亞相上的分子數(shù)量過(guò)多，分子之間分散不完全，在壓縮過(guò)程中可能出現(xiàn)堆層現(xiàn)象，不能形成穩(wěn)定的固相區(qū)域。據(jù)此分析,制備DEAE-瓊脂糖LB膜最佳濃度為0.5 mg/mL。

2.2.3 BAM結(jié)果

利用BAM研究了DEAE-瓊脂糖單分子膜的成膜過(guò)程，圖4為表面壓為0 mN/m和34 mN/m的BAM圖像結(jié)果。通過(guò)對(duì)BAM圖像的觀測(cè)，可以看出其成膜過(guò)程，確定其是否成膜。圖4-a為DEAE-瓊脂糖剛滴加在亞相上的BAM圖像，分子被平鋪在亞相表面，相對(duì)分散，呈氣相狀態(tài)，此時(shí)布魯斯特角的折射不受表面分子影像，圖像顏色較深，看不出分子的具體形態(tài)。待其揮發(fā)一定時(shí)間后,隨著滑障的持續(xù)壓縮，DEAE-瓊脂糖由分散狀態(tài)到聚集成膜，最后在亞相上形成相對(duì)穩(wěn)定的固相區(qū)域。圖4-b為固相狀態(tài)下的DEAE-瓊脂糖單分子膜，可以看出此時(shí)分子之間排列緊密，分子間距較小，已經(jīng)形成固相狀態(tài)。由于分子在亞相表面緊密排列形成了單分子層，改變了布魯斯特角的折射，使得圖像的顏色變淺。通過(guò)對(duì)表面壓為0 mN/m和34 mN/m的BAM圖像對(duì)比可以看出，DEAE-瓊脂糖分子由一開(kāi)始的分散狀態(tài)到達(dá)最后穩(wěn)定的固相狀態(tài)，成功形成了穩(wěn)定的便于提拉的單分子層。

2.3 DEAE瓊脂糖朗格繆爾膜表面電勢(shì)

利用表面電勢(shì)分析儀研究了不同配基密度對(duì)LB膜表面電勢(shì)的影響，圖5為不同配基密度DEAE-瓊脂糖LB膜表面電勢(shì)圖像。結(jié)果表明隨著配基密度的增加其表面電勢(shì)不斷增加，LB膜性質(zhì)越穩(wěn)定。

圖4表面壓為0 mN/m和34 mN/m的BAM圖像

圖5不同配基密度DEAE-瓊脂糖LB膜表面電勢(shì)

表面電勢(shì)的測(cè)定可以看出不溶膜是否均勻以及其性質(zhì)是否穩(wěn)定。亞相表面有不性溶膜的存在，這便會(huì)引起水面上電勢(shì)的變化，因而固-液表面成膜前后有電勢(shì)差ΔV生成。成膜分子剛滴加在亞相上時(shí)，分子之間間隔相對(duì)較大，表面電勢(shì)相對(duì)較小；隨著劃障的不斷壓縮，分子越來(lái)越聚集，每個(gè)分子帶有一定的電荷數(shù)，相同檢測(cè)面積下表面電勢(shì)隨著分子的增多逐漸增大；之后亞相上的分子被壓縮到一定程度時(shí)會(huì)形成穩(wěn)定的單分子層，此時(shí)分子之間距離非常小，且趨于穩(wěn)定狀態(tài)，電勢(shì)差不發(fā)生很大變化。從圖5可以看出，在配基密度非常小的時(shí)候，每個(gè)分子所帶的電荷數(shù)較小，在壓縮過(guò)程中產(chǎn)生的電勢(shì)差非常小，基本可以忽略不計(jì)。但將配基密度增大，隨著滑障的壓縮，DEAE瓊脂糖單分子層排列越緊密，產(chǎn)生了一定的電勢(shì)差，在到達(dá)固相區(qū)域后相對(duì)穩(wěn)定。隨著配基密度的增加，DEAE-瓊脂糖所帶的配基增多，每個(gè)分子所帶的電荷數(shù)增多，隨著滑障壓縮到一定區(qū)域，在相同檢測(cè)面積下總的分子量不變但電荷數(shù)增多，使得電勢(shì)差變大，進(jìn)而表面電勢(shì)變大。隨著配基密度的增大，單分子膜性質(zhì)越來(lái)越穩(wěn)定。

2.4 LB膜的AFM表征

利用AFM對(duì)DEAE-瓊脂糖LB膜性質(zhì)進(jìn)行研究。圖6為空白硅片與DEAE-瓊脂糖LB膜的AFM 3D圖像，結(jié)果表明制備的DEAE-瓊脂糖LB膜性質(zhì)較好。從AFM圖像中可以直觀看出其表面形貌，如若其表面相對(duì)平坦，無(wú)孔存在，厚度相對(duì)均勻，則可表明其制備成功。圖6-a為空白硅片的AFM圖像，硅片清洗后表面潔凈，觀測(cè)不到雜質(zhì)存在。除此之外，空白硅片表面平整，厚度約為1.3 nm，可以作為DEAE-瓊脂糖LB膜提拉的基片。采用垂直提拉法將DEAE-瓊脂糖LB膜轉(zhuǎn)移到干凈硅片上，進(jìn)行AFM檢測(cè)，掃描范圍由大到小。通過(guò)圖6-b可以看出，轉(zhuǎn)移到硅片上的單分子層呈平鋪狀態(tài)，分子分散均勻，膜的表面相對(duì)平坦，觀察不到有孔存在，厚度相對(duì)均勻。通過(guò)空白硅片的高度約為1.3 nm，膜沉積后的硅片高度為9.2 nm，可以估算出DEAE-瓊脂糖LB膜的厚度約為7.9 nm。這與之前報(bào)道的納米微晶纖維素LB膜的厚度是7.2 nm相符合[21]。通過(guò)軟件測(cè)得DEAE-瓊脂糖LB膜表面粗糙度Ra(輪廓算術(shù)平均偏差)為2 nm，表明膜的表面雖不完全平坦，但相對(duì)均勻。通過(guò)以上分析可以得出，DEAE-瓊脂糖LB膜制備成功，性質(zhì)穩(wěn)定并且被成功轉(zhuǎn)移到硅片上。

圖6空白硅片(2μm×2μm)與DEAE瓊脂糖LB膜(6μm×6μm)AFM 3D圖像

3結(jié)論

DEAE-瓊脂糖作為一種新型LB膜材料，可應(yīng)用于生物大分子性能研究、藥物制劑改良、新型生物功能器件研發(fā)等多個(gè)方面。為了制備新型的DEAE-瓊脂糖LB膜，篩選了正丁醇作為鋪展溶劑，使得瓊脂糖能夠在亞相上鋪展，具備形成LB膜的基本條件；發(fā)現(xiàn)DEAE-瓊脂糖朗格繆爾膜成膜過(guò)程與標(biāo)準(zhǔn)成膜過(guò)程相符合；確定了DEAE-瓊脂糖朗格繆爾膜的最佳成膜濃度為0.5 mg/mL。采用BAM觀測(cè)，可以看出分子之間排列緊密，形成一層不溶性薄膜；發(fā)現(xiàn)隨著DEAE配基密度的增加，其表面電勢(shì)逐漸增加。將DEAE-瓊脂糖LB膜提拉到硅片上利用AFM對(duì)其進(jìn)行表征，觀察到分子之間排列緊密，表面粗糙度Ra為2 nm,估算出其厚度約為7.9 nm。以上結(jié)果表明，成功制備出性質(zhì)穩(wěn)定的DEAE-瓊脂糖LB膜。